qPCR引物設計原則：

1. 引物應在核酸保守區內設計并具有特異性；

2. 引物長度一般在17-25個堿基之間，上下游引物長度不宜相差太大；

3. 引物G+C含量應在40%-60%之間，最好在45%-55%之間，引物中堿基要隨機分布；

4. 引物Tm值在58-62°C之間，上下游引物Tm值不宜相差太大，最好不要超過5°C；

5. 引物3’端要避開密碼子的第3位；

6. 引物的5’端可以修飾，而3’端不可以修飾；

7. 擴增產物長度在80-200 bp，最長不要超過300 bp；

8. 擴增產物不能形成二級結構。

探針設計原則：

1. 探針位置應盡可能接近正向或者反向引物，但是不能與之有重合區域；

2. 探針長度通常在25-35 bp之間，保證結合的特異性；

3. 探針的Tm值通常在65-70℃之間，比引物的Tm值高5–10℃，確保探針與模板結合的穩定性大于引物與模板結合的穩定性，GC含量在40-60%；

4. 探針5'端不應含G，因為5’端G能夠淬滅熒光信號，避免報告基團的熒光在探針切割后發生淬滅。

5. 應避免連續相同的堿基出現，特別是連續GGGG；

6. 如果序列中包含多態性位點，應使其位于探針序列中間；

7. 5’端熒光報告基團與3’端淬滅基團選擇：

1）、選擇報告基團時確認最大激發波長（Excitation wavelength，Ex）和最大發射波長（Emission wavelength，Em）與儀器是匹配的。對于多重反應，標記不同探針的報告基團的最大發射波長（Em）應該至少有15 nm的差異。

2）、對于淬滅熒光基團，必須要保證其吸收光譜與報告基團的發射光譜有重合。